V experimentech PCR (polymerázová řetězová reakce) se může balení zdát jednoduché, ale přímo ovlivňuje stabilitu činidla, snadné použití a spolehlivé výsledky. Ať už připravuje činidla nebo komerční premixy, zda ukládání a přepravu laboratoře -, zvládnutí správných technik balení PCR se může vyhnout běžným chybám a zlepšit experimentální účinnost. Níže sdílíme praktické tipy na výběr materiálu, strategie balení a podrobnosti o úložišti.
I. Výběr materiálu balení: Prioritizace kompatibility a ochrany
Reakce PCR jsou citlivé na teplotu, světlo a kontaminanty, takže balicí materiály musí splňovat tři klíčové požadavky: vzduchotěsnost, světlo - a chemická inertnost.
Pro odstředivé trubice a PCR destičky je preferováno polypropylen (PP), díky své vysoké průhlednosti a DNASE/RNASE - Volné vlastnosti . 0.2 Ml Thin -Thin - je ideální pro rychlé přenos tepla, zatímco 0,5 ML Trubky jsou lépe vhodné pro soustředěné koncentrace. Pro 96 - Well PCR destičky doporučujeme vybrat si sukní design (pro snadnou robotickou manipulaci) nebo nekloučený design (pro zachování prostoru).
Metoda těsnění: Konvenční odstředivé zkumavky používají ploché nebo zvýšené uzávěry (aby se zabránilo odpařování a vysychání). Avšak pro dlouhé - termín úložiště, teplo - těsnicí film (jako je Parafilm) nebo prodyšný film (jako je Aeraseal), pro vyvážení vnitřního a vnějšího tlaku. PCR destičky se doporučuje používat lepidlové tmely na hliníkové fólii (vysoká - odolná proti teplotě) nebo Self - Adhesivní film (pro jednotlivé - použití).
Ochrana světla: Cengencies obsahující světlo - citlivé ingredience (jako jsou určitá barviva nebo primery) by měly být zabaleny do hliníkové fólie nebo by měly být použity černé destičky PCR (dostupné od některých výrobců).
Ii. Techniky alikvování: Minimalizace ztrát z opakovaného zmrazení - Thaw Cycles
Alikvování činidel je hlavním krokem v balení PCR a přímo ovlivňuje experimentální reprodukovatelnost.
Alikvování Master Mix: Komerční hlavní mixy (jako je enzym Taq a směs DNTP) se doporučuje, aby byly alikvovány na základě reakčního objemu plus 5% - 10% okraje (např. Pro 20 μl reakci, alikvot 22 μl na zkumavku). Vyvarujte se používání přímo z hromadného obalu, protože opakované zmrazení - Cykly tání mohou vést ke snížené aktivitě enzymu (enzym TAQ může ztratit přibližně 5% aktivitu na cyklus zmrazení-táw).
Primery a šablony: Primery (zejména vlastní primery) se doporučuje, aby byly alikvovány ze 100 μm zásobních roztoků a uloženy na - 20 stupňů. Před použitím se zředí na pracovní koncentraci (obvykle 0,1–1 μm). Šablony, jako je genomická DNA, by měly být alikvotovány v jednom - používat množství, aby se zabránilo křížové kontaminaci.
Tipy pro prevenci kontaminace: Zajistěte, aby trubice odstředivek byly suché před alikvotováním (zbytkový ethanol může inhibovat PCR), pre - chladné pipetové špičky, aby se zabránilo tomu, aby se studená činidla držela ke zdi, a nosí rukavice po celý proces, aby se zabránilo kontaminaci kožní DNA.
Iii. Označování a vedení záznamů: Vyhněte se pasti „černé skříňky“
Jasné označování je zásadní pro obaly PCR; Nesprávné označování může zničit celý experiment.
Povinné informace o označování: Název činidla (např. „2 × taq mastermix“), koncentrace/obsah (např. „10 mm DNTPS“), číslo dávky (pro sledovatelnost), podmínky skladování (např. „-20 stupňů chráněno od světla“), alikvotní datum a datum vypršení (např., „Použití,„ použití, „použití,„ použití, „použití,„ použití, „použití,„ použití, „použití,„ použití, „použití,„ použití, „použití,„ použití, „použití,„ použití, „použití,„ použití, „použití,„ použití, „použití,„ použití, „použití,„ použití, „použití,„ použití, „použití,„ použití, „použití do 6 měsíců“).
Zvláštní značení: Pokud činidlo obsahuje glycerol (nemrznoucí směs), barviva (např. Green SYBR) nebo přísady (např. BSA), musí být poskytnuty další informace (např. „Obsahuje 50% glycerolu, neukládají při vysokých teplotách“).
Synchronizace záznamu: Doporučuje se použít tabulku nebo laboratorní správu softwaru (např. Labguru) k zaznamenávání podrobných parametrů obsahu každé trubice (např. Sekvence primerů, hodnota TM) a spojit je s číslem fyzického štítu.
IV. Skladování a přeprava: Vyvážení teploty a fyzická ochrana
Stabilita činidel PCR je vysoce závislá na podmínkách skladování a během přepravy je nutná další ochrana.
Obecné úložiště:
Enzymy (taq, reverzní transkriptase): dlouhé - úložiště termínu při - 20 stupňů (vyhněte se opakovaným cyklům mýtů; alikvot a uchovávejte -80 stupňů pro budoucí použití);
Primery/sondy: Ukládejte -20 stupňů déle než 1 rok (pokud obsahuje modifikovanou skupinu, jako je biotin, chrání před světlem);
Enzymové vyrovnávací paměti non - (např. PBS): krátké - Termín úložiště při 4 stupních (až 1 měsíc).
Požadavky na dopravu:
Pro přepravu studeného řetězce použijte suchý led (- 78 stupňů) pro enzymy (udržované pod -20 stupňů) a modrý led (asi 0 stupňů) pro pufry pro krátkodobé přepravu.
Vyhněte se nadměrným vibracím (destičky PCR by měly být zajištěny v pěnovém boxech, aby se zabránilo míchání činidel mezi jamkami).
Během vysokých letních teplot přidejte do obalu izolační vrstvu (např. Izolační vak z hliníkové fólie + zmrazený gelový balíček).
V. Běžné problémy a řešení
Problém 1: Srážení činidla (např. DNTPS nebo MGCL₂ srážení při nízkých teplotách) → Roztok: krátce odstředění (1000 ot / min, 1 minuta) před alikvotováním. Před použitím se rozpusťte v inkubátoru 37 stupňů a víru, aby se důkladně promíchala.
Problém 2: Deskové těsnění snadno odlupuje → Řešení: Vyberte teplo - Odolný těsnění s lepicí podložkou nebo použijte tepelný tmel (vhodný pro experimenty s vysokou -).
Problém 3: rozmazané štítky → Řešení: Použijte vodotěsnou značku (jako je Sharpie) nebo laser - tiskové štítky, aby se zabránilo vymazání rukopisu alkoholem.
Závěr
Balení PCR je více než jen „balení“ činidla; Je to první obranná linie experimentální spolehlivosti. Výběrem vhodných materiálů, standardizací procesu alikvotingu, udržováním důkladného označování a udržováním přísné kontroly teploty během přepravy můžete výrazně snížit lidskou chybu a zajistit stabilnější následné amplifikační reakce a spolehlivější výsledky. Pamatujte: Detaily určují úspěch. Správné praktiky balení PCR mohou ušetřit významné odstraňování problémů s časem během celého experimentu!